WWW.NAUKA.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Книги, издания, публикации
 


«Общая характеристика работы Актуальность проблемы. Основным направлением развития спиртовой промышленности является внедрение ресурсосберегающих технологий, основанных на повышении ...»

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Основным направлением развития спиртовой

промышленности является внедрение ресурсосберегающих технологий,

основанных на повышении эффективности переработки зернового сырья,

увеличении выхода целевого продукта и снижении образования отходов. По

традиционной технологии при производстве спирта для разжижения и

осахаривания крахмала зерна применяют ферментные препараты

амилолитического действия:

-амилазы и глюкоамилазы. Рядом исследователей (Гернет М.В., Синициным А.П., Мазур Н.С., Оверченко М.Б., Римаревой Л.В., Родзевич В.И. и др.) было показано, что применение ферментов, катализирующих гидролиз некрахмальных полисахаридов и фитина зерна, способствует более эффективному использованию полимеров растительного сырья, повышению выхода спирта и интенсификации процессов брожения.

Одним из перспективных продуцентов гидролитических ферментов для осахаривания крахмалсодержащего сырья является штамм Aspergillus awamori М-2002, полученный на основе низкопродуктивного промышленного продуцента Aspеrgillus awamori ВУД-Т2. Данный штамм синтезирует уникальный комплекс ферментов, в состав которого входят глюкоамилаза, амилаза и небольшое количество ферментов целлюлолитического и гемицеллюлолитического действия. Тем не менее, промышленный выпуск ферментных препаратов на основе данного штамма нерентабелен – в первую очередь, из-за нестабильности продуцента.

В связи с этим, актуальной задачей является увеличение уровня стабильной экспрессии глюкоамилазы штамма A. awamori М-2002 и создание на его основе рекомбинантных штаммов – продуцентов ферментов, гидролизующих некрахмальные полисахариды (НПС) и фитин зерна.

Выполнение этой задачи позволит получить конкурентоспособные ферментные препараты для эффективной конверсии зернового сырья, снизит их себестоимость и повысит рентабельность производства ферментных препаратов.

Цели и задачи исследования. Целью работы является получение рекомбинантных штаммов - продуцентов ферментов для эффективной конверсии зернового сырья на основе промышленного штамма Aspergillus awamori М - 2002 (ВКМ F-3771D).

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• Получить стабильный реципиентный штамм для проведения дальнейших генно-инженерных работ по повышению его биосинтетической способности.

• Создать универсальную систему экспрессии генов.

• Получить высокоэффективные рекомбинантные штаммы с заданными свойствами и разработать методики поддержания полученных рекомбинантных штаммов.

• На основе полученных рекомбинантных штаммов наработать опытные образцы ферментных препаратов (ФП).

• Изучить компонентный и биохимический состав полученных ФП и их гидролитическую способность по отношению к полисахаридам зернового сырья.

• Исследовать эффективность применения новых ФП в спиртовом производстве.

Научная новизна. Методами селекции с применением индуцированного мутагенеза получен новый стабильный штамм A. awamori 6804. Впервые создана универсальная система экспрессии генов для штамма A. awamori 6804 на основе промотора и терминатора гена глюкоамилазы A. awamori 6804. С использованием этой системы получены новые рекомбинантные штаммы, обладающие повышенной биосинтетической способностью по отношению к ферментам, необходимым для эффективной конверсии зернового сырья.

Впервые созданы рекомбинантные штаммы, способные наряду с глюкоамилазой экспрессировать ферменты, катализирующие гидролиз некрахмальных полисахаридов и фитина зерна. На основе установленных закономерностей выявлена возможность направленной регуляции биосинтеза отдельных ферментов у штаммов A. awamori при использовании в качестве индукторов продуктов расщепления полимерных субстратов (например, мальтодекстрина).

Установлена взаимосвязь между составом ферментативных комплексов, синтезируемых рекомбинантными штаммами A.awamori, их гидролитической способностью по отношению к полисахаридам зернового сырья и эффективностью сбраживания зернового сусла.

Получены новые Практическая значимость работы.

высокоэффективные рекомбинантные штаммы A.awamori amyR-Т-19, A.awamori Т-14, A.awamori Xyl-Т-15, A.awamori EG-73 и A.awamori Phy-7 – продуценты глюкоамилазы, ксиланазы, эндоглюканазы и фитазы, биосинтетическая способность которых превышает уровень активности исходного промышленного штамма по глюкоамилазе на 30%, по ксиланазе – в 3 раза, по

-глюканазе – в 4-6 раз, по фитазе в 300 раз. Штаммы A.awamori amyR-Т-19 и A.awamori Xyl-Т-15 депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ F-4277D, F-4278D). Разработаны паспорта на штаммы, составлены «Методические рекомендации по поддержанию рекомбинантных штаммов и ведению посевного материала».

Проведены производственные испытания полученных рекомбинантных штаммов A. awamori в условиях ОАО «Спиртовый комбинат» г. Мариинск.

Подтверждено, что практическая реализация результатов исследований позволяет получать на основе новых рекомбинантных штаммов A. awamori высокоактивные комплексные ферментные препараты без изменения основного технологического процесса, обеспечивая повышение выхода целевых ферментов. Производство ферментных препаратов на основе новых высокоактивных рекомбинантных штаммов A. awamori повысит экономические показатели за счет сокращения количества ферментаций и расхода фермента на осахаривание. Разработаны «Технологическая инструкция» и «Технические условия» на новые ферментные препараты.

Показана высокая эффективность использования комплексных ферментных препаратов глюкоамилазы, полученных на основе высокоактивных рекомбинантных штаммов, в спиртовом производстве. Их применение позволило повысить степень конверсии полисахаридов зернового сырья с образованием дополнительного количества сбраживаемых углеводов, исключить введение дополнительных источников гемицеллюлаз, улучшить реологические свойства зернового сусла и снизить его вязкость в 1,3 раза, интенсифицировать процесс брожения и повысить выход спирта на 1,2 %.

Экономическая эффективность от производства 100 т комплексного ферментного препарата глюкоамилазы на основе новых рекомбинантных штаммов составит порядка 15-20 млн. руб.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: International Conference «BIOCATALYSIS 2009: Fundamentals&Applications» (Arkhangelsk, 2009), Пятый Московский Международный Конгресс «Биотехнология: Состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), Научно-практическая конференция «Современные биотехнологии переработки сельскохозяйственного сырья и вторичных ресурсов» (Углич, 2009). Международная научная конференция студентов и молодых ученых «Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и средств переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания» (Москва, 2009), Международная научно-практическая конференция «Инновационные технологии в пищевой промышленности»

(Минск, 2009), Международный симпозиум “Перспективные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК» (Москва, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (262 источника). Диссертация содержит 210 страниц печатного текста, включает 32 рисунка и 48 таблиц.

–  –  –

Объектом исследования являлся штамм A. awamori М-2002 (ВКМ, FD). В работе использовали общепринятые микробиологические, биохимические и физико-химические методы исследования, а также популярные методы генной инженерии, в т.ч. ПЦР, инверсный ПЦР, сайтнезависимое лигирование.

Определение глюкоамилазной и амилолитической активности проводили в соответствии с ГОСТ 20264.4-89. Определение ксиланазной, -глюканазной и эндоглюканазной активности основывали на измерении скорости образования восстанавливающих сахаров методом Шомоди-Нельсона при гидролизе:

ксилана из древесины березы, -глюкана ячменя и Na-соли карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), соответственно (Синицын А.П. и др., 1995, Полыгалина и др., 2003). Для определения фитазной активности использовали метод, основанный на измерении скорости образования свободных фосфатионов (Рi) при гидролизе фитата Na из зерен риса с использованием аммониймолибденового реагента (13 мМ FeSO4·7H2O, 8,1 мМ (NH4)6Mo2O24·4H2O и 0,533 М H2SO4). За единицу фитазной активности принимали такое количество фермента, которое приводит к образованию 1 мкмоль Рi из 1,4 мМ раствора фитата Na за 1 мин при 37°С и рН 5,0 (Синицына О.А. и др., 2006).

Содержание растворимого белка определяли методом Лоури.

Статистическую обработку результатов, полученных не менее чем в 3-х повторностях, проводили по программе Excel Microsoft Word.

2.2 Результаты исследований и их обсуждение 2.2.1 Получение стабильного штамма A. awamori 6804 методом селекции с применением ионизирующего гамма-излучения Работа по получению стабильного штамма A. awamori 6804 проводилась с использованием кобальтового источника ионизирующего -излучения в НИФХИ им. Карпова. В качестве исходного штамма в селекционной работе был использован нестабильный A. аwаmori М-2002, уровень его глюкоамилазной активности колебался от 350 до 620 ед/см3 культуральной жидкости (КЖ). Для выделения наиболее активных вариантов после -облучения использовали следующие схемы селекции:

- рассев вегетативных клеток из культуральной жидкости в процессе культивирования продуцента на селективные среды, обогащенные селектирующими добавками;

- глубинный рассев спор продуцента на бедные селективные среды с последующим наслаиванием на проросшие споры среды Чапека.

С использованием указанных схем селекции был выбран наиболее стабильный штамм A. awamori 6804, который при глубинной ферментации обеспечивал активность глюкоамилазы 580±20 ед/см3 КЖ (рис.1). Отобранный штамм проверен на стабильность продукции глюкоамилазы в нескольких генерациях и в отличие от штамма A. awamori М-2002 сохранил уровень активности целевого фермента в 5 генерациях, что свидетельствует о высокой стабильности данного штамма по признаку биосинтеза глюкоамилазы (рис.1).

–  –  –

Рисунок 1 - Сравнение активности глюкоамилазы штаммов A.awamori в процессе хранения при пересевах Штамм A. awamori 6804 использовали для получения рекомбинантных штаммов - продуцентов глюкоамилазы и сопутствующих ферментов, применяя стандартные методы генной инженерии.

2.2.2 Получение ауксотрофных мутантов штамма A. awamori 6804, обладающих признаками niaDДля работы с грибами рода Aspergillus широко используется трансформационная система метаболического пути ассимиляции азота. Метод основан на получении мутантов niaD-, дефектных по ферменту нитратредуктазе, и, вследствие этого, неспособных расти на минимальной среде, где в качестве единственного источника азота используется нитрат натрия. Вторым признаком, отличающим niaD- мутанты, является их устойчивость к хлорату натрия. При этом должна сохраняться способность к биосинтезу всех секретируемых ферментов как у исходного штамма. Опыты по получению niaD- мутантов штамма A. awamori 6804 выполнялись в соответствии со следующей схемой:

–  –  –

Из популяции обработанных клонов было выделено 2 варианта с фенотипом niaD– (табл. 1). Полученные штаммы после хранения в течение двух месяцев были проверены на реверсию к прототрофному типу и на способность к биосинтезу глюкоамилазы при глубинном культивировании (табл. 1).

Таблица 1 – Глюкоамилазная активность в КЖ niaD- мутантов A. awamori

–  –  –

В качестве реципиента выбран клон A.awamori 6804-19 (niaD–), при ферментации которого на стандартной среде получена стабильная глюкоамилазная активность до 600 ед/см3 КЖ, что позволяет использовать этот штамм как реципиент для получения высокоэффективных штаммов продуцентов глюкоамилазы и НПС-гидролизующих ферментов методом плазмидной трансформации.

–  –  –

Наиболее продуктивным подходом к увеличению экспрессии целевых белков является создание экспрессионных систем на основе регуляторных элементов генов мажорных белков.

Для создания экспрессионных конструкций были амплифицированы промотор и терминатор гена glaA, кодирующего глюкоамилазу A.awamori 6804, и получена плазмида pPrGA-GAAwa, содержащая ген глюкоамилазы (рис. 4). На основе нуклеотидных последовательностей, соответствующих регуляторным областям гена глюкоамилазы, сформирован вектор pGA, обеспечивающий встраивание целевого гена в хромосому A.awamori по принципу гомологичной рекомбинации (рис. 4). На основе вектора pGA получены экспрессионные плазмиды, обеспечивающие экспрессию гетерологичных ксиланазы P. canescens, эндоглюканазы I T. reesei и фитазы A. niger (рис. 4).

Рисунок 4 – Схема получения плазмид для обеспечения гетерологичной экспрессии в рекомбинантном штамме A.awamori 6804

–  –  –

2.2.5 Получение высокоэффективных рекомбинантных штаммов A.awamori - продуцентов глюкоамилазы Для получения высокоэффективных рекомбинантных штаммов продуцентов глюкоамилазы были проведены трансформации штамма A.awamori 6804 niaD- плазмидами, несущими ген амилолитического активатора и ген глюкоамилазы. В результате проведенных экспериментов была создана коллекция рекомбинантных штаммов с увеличенной продукцией глюкоамилазы (рис. 5).

–  –  –

niaDПосле трансформации стабильного штамма A.awamori 6804 плазмидой pAN52amyR и плазмидой pPrGA-GAAwa отобраны трансформанты A.awamori amyR-Т-19 и A.awamori Т-14 с уровнем активности глюкоамилазы, превышающим контрольный штамм примерно на 30%.

Таким образом, увеличение глюкоамилазной активности, вызванное, видимо, умножением числа копий гена, кодирующего глюкоамилазу, не превышало эффект от увеличения уровня белка активатора гена amyR. Лучший трансформант, полученный в экспериментах с включением гена активатора, был подвергнут вначале мутационному превращению в ауксотрофный штамм A.awamori Т-64 niaD- и далее трансформирован плазмидой pPrGA-GAAwa. В результате получен штамм A.awamori Т-29. Выполнение этих экспериментов было осуществлено для проверки результатов по котрансформации, в которых вероятность получения желаемого эффекта от включения одновременно двух разных плазмид была заведомо меньше. Как видно из данных, увеличения глюкоамилазной активности в результате проведенных процедур не наблюдали.

Результаты проведенных серий экспериментов по трансформации различных вариантов производственного штамма A. awamori М-2002 генами amyR и glaA глюкоамилазы позволяют заключить, что, вероятно, увеличение продуктивности на 30% является пределом, допускаемым механизмом регуляции амилолитических генов в грибах рода Aspergillus при включении добавочных копий этих генов.

2.2.6 Получение высокоэффективных штаммов A. awamori – продуцентов ферментов, гидролизующих некрахмальные полисахариды и фитин Используя аналогичный подход, в результате проведенных трансформаций реципиентного штамма A. awamori 6804-19 niaD- плазмидами, несущими гетерологичные гены ксиланазы, эндоглюканазы и фитазы, получены перспективные рекомбинантные штаммы с увеличенной продукцией целевых ферментов (табл. 3).

Уровень экспрессии секретируемой ксиланазы, эндоглюканазы и глюканазы повысился примерно в 3, 6 и 8 раз, соответственно. Максимальный эффект был получен при трансформации штамма плазмидой pGA-PhyА — фитазная активность штамма была увеличена в 300 раз.

Таблица 3 – Сводные данные по активности глюкоамилазы и целевых ферментов в КЖ рекомбинантных штаммов A. awamori

–  –  –

2.2.7 Компонентный состав комплексных ферментных препаратов, полученных на основе рекомбинантных штаммов A.awamori Целесообразным являлось определение компонентного состава секретируемого ферментного комплекса новыми рекомбинантными штаммами.

Для этого проведено аналитическое фракционирование полученных экспериментальных образцов концентрированных ферментных препаратов (рис. 6).

–  –  –

Рисунок 6 – Содержание индивидуальных ферментов в ферментных препаратах На хроматограммах во всех случаях наблюдали два основных белковых пика: первый соответствовал «легкой» форме глюкоамилазы (80 кДа), второй – ее «тяжелой» форме (140 кДа).

В контрольном препарате, полученном на основе штамма A. awamori 6804, преобладающей являлась “тяжелая” форма глюкоамилазы – ее содержание составило 39% от общего пула белка, “легкой” формы – 32%. Отметим, что контрольный препарат характеризовался наличием «собственной» ксиланазы – ее содержание составило 0,15% от общего пула белка.

При фракционировании препарата A.awamori Xyl-15 содержание общей ксиланазной фракции составляло 3 % от общего пула белка. Для препарата A.awamori EGI-46 содержание рекомбинантной эндоглюканазы T. reesei составило 14% от общего пула белка. При фракционировании препарата A.awamori Phy-7 содержание рекомбинантной фитазы A. niger составило 2,4% от общего пула белка. Ни в одной фракции контрольного препарата A. awamori 6804 не было обнаружено заметной фитазной активности. Содержание «легкой»

и «тяжелой» формы глюкоамилазы не изменялось.

2.2.8 Поддержание коллекции рекомбинатных штаммов A.awamori

Коллекцию полученных высокоактивных рекомбинатных штаммов A.awamori – продуцентов глюкоамилазы и сопутствующих ферментов периодически тестировали на способность к продукции целевых ферментов при глубинном культивировании в течение 9 суток. В качестве контроля использовали штамм A. awamori 6804. Полученные данные по стабильности продукции целевых ферментов в процессе хранения рекомбинантных штаммов A. awamori в нескольких генерациях были статистически обработаны.

Результаты проверки стабильности биосинтеза глюкоамилазы показали, что штаммы сохраняют высокий уровень активности глюкоамилазы в течение полугода при хранении на скошенном агаре при пяти пересевах (рис.7).

Результаты проверки стабильности рекомбинантных штаммов продуцентов ферментов, катализирующих гидролиз НПС и фитина, также показали, что штаммы стабильны и сохраняют высокий уровень активности целевых ферментов в течение полугода при четырех пересевах (рис. 8) при глубинном культивировании в течение 7 суток.

Таким образом, все полученные методом плазмидной трансформации рекомбинатные штаммы A.awamori сохраняли высокий уровень активности целевых ферментов, что говорит о стабильности интегративной встройки ДНК в хромосому гриба, и целесообразности их применения в спиртовой промышленности.

1-ый пассаж 2-ой пассаж 3-ий пассаж 4-ый пассаж 5-ый пассаж ГлА, ед/см3 600

–  –  –

Рисунок 7 – Проверка стабильности биосинтеза глюкоамилазы высоактивными рекомбинантными штаммами A. awamori - продуцентами глюкоамилазы в процессе хранения

–  –  –

Рисунок 8 – Проверка стабильности биосинтеза целевых ферментов у рекомбинантных штаммов A.awamori - продуцентов ферментов для гидролиза НПС и фитина в процессе хранения 2.2.9 Биоконверсия некрахмальных полисахаридов зернового сусла комплексными ферментными препаратами, полученными на основе рекомбинантных штаммов Aspergillus awamori Комплексные ферментные препараты получали при глубинном культивировании высокоактивных рекомбинантных штаммов A. awamori на производственной питательной среде (24% пшеничной муки) с последующим выделением ФП методом осаждения. Ферментные препараты использовались в спиртовом производстве на стадии осахаривания крахмалсодержащего сырья как источники глюкоамилазы и ферментов, катализирующих гидролиз некрахмальных полисахаридов.

Сравнительный анализ уровня активности опытных образцов ферментных препаратов показывает, что практически все исследуемые препараты проявляют более высокий уровень активности по основному ферменту – глюкоамилазе и содержат комплекс ферментов ксиланазного, глюканазного и целлюлазного действия (табл. 4).

Таблица 4 – Сравнительная характеристика уровня активности целевых ферментов в исследуемых ферментных препаратах

–  –  –

В связи с этим, применение новых комплексных ФП глюкоамилазы перспективнее, поскольку существующие промышленные ФП (Глюкаваморин Г18х) требуют дополнительного введения ФП целлюлаз и гемицеллюлаз.

Например, при производстве спирта широко используется ФП Брюзайм BGX (Dyadic International). Кроме того, при использовании новых высокоактивных комплексных препаратов из рекомбинантных штаммов снижается и общий расход ФП, т.к. их дозируют по глюкоамилазной активности.

2.2.9.1 Гидролитическая способность ФП рекомбинантных штаммов A.awamori по отношению к полисахаридам зернового сырья Различные виды зерна кроме крахмала содержат некрахмальные полисахариды – ксиланы, -глюканы, целлюлозу, причем содержание НПС может различаться в зависимости от вида сырья (табл.5).

Таблица 5 – Содержание полисахаридов в основных видах зерна

–  –  –

Ферментные препараты – источники ксиланаз и -глюканаз эффективны при переработке ржи, тогда как для ячменя целесообразно применять ферментные препараты, содержащие наряду с -глюканазной и ксиланазной активностью высокий уровень целлюлолитических ферментов.

Исследовали гидролитическую способность комплексных ФП глюкоамилазы по отношению к полисахаридам пшеницы, кукурузы, ржи и ячменя в процессе осахаривания зернового сусла. При одинаковом расходе глюкоамилазы – 6 ед/г крахмала, доза расхода ферментов, гидролизующих НПС, варьировалась (табл. 6). В качестве контроля использовали ферментный препарат исходного штамма A.awamori 6804.

Таблица 6 – Соотношение целевых активностей в используемых ФП

–  –  –

Как видно из табл. 6 при одинаковой вносимой дозировке глюкоамилазы наибольшее содержание ксиланазы было отмечено в ферментных препаратах A. awamori Xyl-15 и A. awamori EGI-73, что позволяет наиболее эффективно использовать эти препараты при переработке ржи и пшеницы. В ФП A.awamori EGI-73 содержание КМЦ-азы увеличено в 15 раз, а -глюканазы в 5 раз, что позволяет применять этот препарат при осахаривании ячменного сусла. ФП A. awamori T-14 и A. awamori T-29 с повышенным содержанием глюкоамилазы целесообразнее использовать для осахаривания пшеничного и кукурузного сусла.

Результаты исследования степени осахаривания зернового сусла подтверждают эффективность использования новых комплексных ФП глюкоамилазы (рис. 9). Осахаренное сусло исследуемых субстратов содержало, в основном, глюкозу и мальтозу. Причем, концентрация глюкозы в опытных пробах при осахаривании ферментными препаратами трансформантов была в 1,5 раза выше, чем при осахаривании ФП исходного штамма A.awamori 6804.

Данный эффект наблюдается за счет гидролиза НПС.

–  –  –

Рисунок 9 – Состав продуктов гидролиза ржаного, кукурузного, ячменного и пшеничного замесов под действием комплексных ФП рекомбинантных штаммов A.awamori на стадии осахаривания 2.2.9.2 Использование комплексных ферментных препаратов рекомбинантных штаммов A. awamori при сбраживании ржаного сусла Подготовку ржаного сусла осуществляли по механико-ферментативной схеме. Комплексные ФП применяли на стадии осахаривания, дозируя их по глюкоамилазе из расчета 6 ед. ГлА/г крахмала. В контрольном варианте в качестве источника глюкоамилазы использовали ФП Глюкаваморин Г18х, в качестве ФП – источника ферментов для гидролиза НПС – импортный препарат Брюзайм BGX, который дозировали по ксиланазе из расчета 0,25 ед. КсА/г крахмала.

Увеличение доли гемицеллюлаз в составе комплекса ФП, полученных на основе рекомбинантных штаммов A. аwamori Xyl-15 и A. аwamori EGI-73, способствовало улучшению реологических свойств сусла, вязкость которого снижалась в 1,2-1,3 раза по сравнению с действием препарата, полученного на основе родительского штамма A.awamori 6804, и увеличению выхода спирта на 1,2 % (рис.10).

Гидролитическая способность экспериментальных образцов ферментных препаратов в сравнении с промышленными препаратами также показала преимущество их использования. Применение препаратов A.awamori EGI-73 и A.awamori Xyl-15 обеспечивало не только снижение вязкости сусла, но и повышение выхода спирта на 0,7-1,2% по сравнению с показателями бражки, где использовали ФП Брюзайм BGX как один из лучших препаратов импортного производства.

–  –  –

Таким образом, применение комплексных ферментных препаратов глюкоамилазы, полученных на основе высокоактивных рекомбинантных штаммов A.awamori, на стадии осахаривания зернового сусла позволяет исключить использование ФП – источников ферментов гемицеллюлазного и целлюлазного действия, осуществив импортозамещение.

2.2.10 Технологии получения и применения новых комплексных ферментных препаратов глюкоамилазы в спиртовом производстве Проведены производственные испытания по получению комплексных ферментных препаратов глюкоамилазы на основе новых рекомбинантных штаммов Aspergillus awamori amyR-Т-19 и Aspergillus awamori Xyl-Т-15 продуцентов глюкоамилазы и ксиланазы в условиях ферментного цеха «Спиртового комбината» (г. Мариинск) в ферментерах объемом 16 м3.

Максимальный уровень активности глюкоамилазы в культуральной жидкости при культивировании рекомбинантного штамма A. awamori amyR-Тбыл достигнут на 216 ч роста и составил 685 – 730 ед/см3 КЖ, что в 3 раза выше уровня глюкоамилазной активности промышленного штамма A. awamori ВУДТ-2. При культивировании штамма A. awamori Xyl-Т-15 – продуцента комплекса ферментов, активность глюкоамилазы составила 480-520 ед/см3, что в 2 раза превышало активность штамма A. awamori ВУДТ-2, а уровень синтеза ксиланазы увеличился до 180-230 ед/см3 (в 8 – 10 раз выше контроля).

Полученные результаты свидетельствуют об успешном внедрении технологии производства ферментных препаратов глюкоамилазы и ксиланазы на основе рекомбинантных штаммов в промышленных условиях.

Проведены производственные испытания по применению полученного высокоактивного ферментного препарата глюкоамилазы - Глюкаваморина Гх (710 ед. ГлА/см3) на основе штамма A. awamori amyR-Т-19 на стадии осахаривания пшенично-ржаного и пшеничного сусла. Технологическая схема производства спирта осуществлялась согласно «Производственнотехнологического регламента получения спирта из крахмалосодержащего сырья» ОАО «Спиртовый комбинат» ПТР 10-40107-04. Применение ФП глюкоамилазы - Глюкаваморина Гх на основе штамма A.awamori amyR-Т-19 позволило получить сусло с высокой концентрацией сухих веществ (21-22%) и сократить расход ферментных препаратов на осахаривание сырья в 2-3 раза (по товарной продукции) по сравнению с ранее применяемым ФП глюкоамилазы с активностью 200-250 ед/см3. В результате сбраживания полученного сусла к 58-60 ч брожения достигнуты нормативные показатели бражки: несброженные углеводы – 0,37-0,43 г/100 см3, концентрация спирта – 11,4-11,5 %об., кислотность бражки – 0,38 град.

Таким образом, проведенные производственные испытания подтвердили результаты лабораторных исследований и эффективность разработанных технологий.

2.2.11 Сравнение технологии применения новых рекомбинантных штаммов A.awamori с существующими технологиями Основные разработанные способы повышения эффективности технологии производства и применения новых ферментных препаратов на основе высокоактивных рекомбинантных штаммов A. awamori по сравнению с существующими технологиями представлены в таблице 7.

–  –  –

Выводы

1. Комбинацией методов селекции и индуцированного мутагенеза получен стабильный мутантный штамм A.awamori 6804 с уровнем активности глюкоамилазы в культуральной жидкости 580±20 ед/см3.

2. На основе штамма A.awamori 6804 получен ауксотрофный штаммреципиент A. awamori 6804-19 для проведения плазмидной трансформации с целью получения рекомбинантных штаммов - продуцентов глюкоамилазы и НПС-гидролизующих ферментов.

3. Разработана методика протопластирования и трансформации штаммареципиента A.awamori 6804-19. Создана универсальная система экспрессии генов для A.awamori на основе промотора и терминатора гена глюкоамилазы (glaA) A.awamori 6804.

4. Методами генной инженерии получены рекомбинантные штаммы, обладающие повышенной активностью целевых ферментов, необходимых для эффективной конверсии полисахаридов зернового сырья:

A.awamori amyR-Т-19, A.awamori Т-14 и A.awamori Т-29 с увеличенной продукцией глюкоамилазы на 30 %;

A.awamori Xyl-15 и A.awamori Xyl-21, ксиланазная активность которых увеличена в 3 раза по сравнению с исходным штаммом;

A.awamori EGI-46 и A.awamori EGI-73, у которых уровень синтеза эндоглюканазы увеличился в 4-6 раз;

A.awamori Phy-7 и A.awamori Phy-39, фитазная активность которых увеличена в 300 раз при сохранении глюкоамилазной активности на уровне контроля.

5. На основе новых рекомбинантных штаммов A.awamori 6804, A.awamori Т-14, A.awamori Т-29, A.awamori Xyl-15 и A.awamori EGI-73 наработаны опытные образцы концентрированных ферментных препаратов и проведены сравнительные исследования их гидролитической способности по отношению к полисахаридам зернового сырья. Установлено, что концентрация глюкозы при использовании ферментных препаратов, полученных из рекомбинантных штаммов A.awamori Xyl-15 и A.awamori EGI-73, в 1,5 раза выше, чем при использовании препарата из родительского штамма A.awamori 6804. Данный эффект связан с гидролизом некрахмальных полисахаридов ферментами целлюлолитического и гемицеллюлолитического действия, синтезируемыми рекомбинантными штаммами.

6. Исследовано влияние новых комплексных ферментных препаратов глюкоамилазы, полученных на основе рекомбинантных штаммов, на реологические и биохимические свойства зернового сусла и бражки. Показано, что их применение способствует улучшению реологических свойств сусла, обеспечивая снижение вязкости в 1,2 – 1,3 раза, повышению выхода целевого продукта на 1,2 %, по сравнению с ферментным препаратом, полученным на основе родительского штамма.

7. Проведены производственные испытания технологии культивирования высокоэффективных рекомбинантных штаммов A.awamori amyR-Т-19 и A.awamori Xyl-15 – продуцентов глюкоамилазы и ксиланазы. Полученные результаты свидетельствует об успешном масштабировании технологии получения препаратов глюкоамилазы и ксиланазы в промышленных условиях.

8. Применение комплексных ферментных препаратов глюкоамилазы, полученных на основе новых высокоактивных рекомбинантных штаммов, положительно влияет на экономические показатели процесса производства спирта за счет снижения расхода фермента на осахаривание, повышения выхода спирта на 0,7-1,2% и снижения технологических потерь сырья. Экономическая эффективность от производства 100 т комплексного ферментного препарата глюкоамилазы на основе новых рекомбинантных штаммов составит порядка 15-20 млн. руб.

Список работ по теме диссертации

1. Середа А.С., Цурикова Н.В., Римарева Л.В., Рожкова А.М., Винецкий Ю.П., Синицын А.П. Создание универсальной системы экспрессии генов для повышения эффективности промышленного штамма Aspergillus awamori.

Сборник научных трудов. VIII Международная научно-практическая конференция «Инновационные технологии в пищевой промышленности».

Минск, 2009, с.88-10.

2. Винецкий Ю.П., Рожкова А.М., Середа А.С., Цурикова Н.В,, Нуртаева А.К., Семенова М.В., Зоров И.Н., Синицын А.П. Увеличение продуктивности глюкоамилазы штамма Aspergillus awamori комбинацией методов радиационного мутагенеза и плазмидной трансформации // Прикладная биохимия и микробиология. – 2010,Т.46, № 6, с.685-692.

3. Рожкова А.М., Середа А.С., Цурикова Н.В., Римарева Л.В., Нуртаева А.К., Семенова М.В., Рубцова Е.А., Зоров И.Н., Синицына О.А, Синицын А.П.

Создание системы экспрессии гетерологичных генов на основе штамма гриба Aspergillus awamori // Прикладная биохимия и микробиология. – 2011,Т.47, № 3, с.308-317.

4. Середа А.С., Игнатова Н.И., Оверченко М.Б., Цурикова Н.В., Римарева Л.В., Рожкова А.М., Зоров И.Н., Синицын А.П. Исследование гидролитической способности комплексных ферментных препаратов, полученных на основе высокоэффективных рекомбинантных штаммов Aspergillus awamori, по отношению к полисахаридам зернового сырья // Хранение и переработка сельхозсырья. – 2011, №3.

5. Sereda A.S., Tsurikova N.V., Rimareva L.V., Rozhkova A.M., Sinitsyn A.P.

Creation of the strain-producer with increased expression level of homologous glucoamylase in the fungus Aspergillus. Abstracts of International Conference «BIOCATALYSIS 2009: Fundamentals&Applications». 19-24 June, Arkhangelsk, 2009, p.109.

6. Середа А.С., Цурикова Н.В., Римарева Л.В., Рожкова А.М., Синицын А.П.

Получение штаммов-реципиентов и повышение уровня экспрессии гомологичных белков в грибах рода Aspergillus. Сборник трудов Пятого Московского Международного Конгресса «Биотехнология: Состояние и перспективы развития». 16-20 марта, Москва, 2009, с. 312-313.

7. Середа А.С., Рожкова А.М., Цурикова Н.В., Римарева Л.В. Создание системы экспрессии гетерологичных генов в штамме Aspergillus awamori.

Сборник научных трудов научно-практической конференции «Современные биотехнологии переработки сельскохозяйственного сырья и вторичных ресурсов». Углич: ВНИИМС, 2009, с. 204-206.

8. Середа А.С., Цурикова Н.В., Костылева Е.В., Римарева Л.В., Рожкова А.М., Синицын А.П. Получение высокоактивных штаммов – продуцентов ферментов для конверсии крахмалосодержащего сырья на основе мицелиального гриба Asp.awamori с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Материалы международной научной конференции студентов и молодых ученых «Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и средств переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания», 10-11 декабря, Москва, 2009, с.62-64.

9. Середа А.С., Цурикова Н.В., Костылева Е.В., Римарева Л.В., Рожкова А.М., Синицын А.П. Получение высокоактивных штаммов – продуцентов ферментов для конверсии крахмалосодержащего сырья на основе мицелиального гриба Aspergillus awamori с использованием технологии рекомбинантных ДНК. 5-ый Международный симпозиум «Перспективные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК». М.:ВНИИПБТ, 2010, с.12-16.

10. Середа А.С., Цурикова Н.В., Костылева Е.В., Римарева Л.В., Рожкова А.М., Зоров И.Н., Синицын А.П. Осахаривание крахмалосодержащего сырья комплексными ферментными препаратами, полученными на основе рекомбинантных штаммов Asрergillus awamori. 5-ый Международный симпозиум «Перспективные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК». М.:ВНИИПБТ, 2010, с.256-260.

Выражаю глубокую и искреннюю признательность д.х.н., проф.

Синицыну Аркадию Пантелеймоновичу, к.т.н. Цуриковой Нине Васильевне и к.х.н. Рожковой Александре Михайловне за помощь и руководство в выполнении диссертационной работы.

Глубокую благодарность выражаю сотрудникам сектора «Биотехнологии продуцентов новых гидролитических ферментов» ГНУ ВНИИ пищевой биотехнологии Россельхозакадемии, лаборатории «Физико-химической ферментативной трансформации биополимеров» МГУ им. М.В. Ломоносова и лаборатории «Биотехнологии ферментов» ИНБИ им. А.Н.Баха РАН за неоценимую помощь при получении экспериментальных данных для диссертационной работы.




Похожие работы:

«МЕЖ ДВУХ ЗЕРКАЛ Об идеальности в разрезе тысячелетий 1. Что такое идеальность? По сути, это неотрывная от материального мира многоликая нематериальная реальность. Она всегда была, есть и будет, ибо непрерывно развивается. В том числе с самым активным участием всего человечества («сознающей себя материи»). Конкретным определениям идеальности нет числа: они постоянно растут вместе с ростом сознания людей. Ребенок, едва появившись на свет, воспринимает, отражает и изобретает простейшие ощущения,...»

«DAS DE LITERATURA EN ESPAOL XVII FERIA INTERNACIONAL DEL LIBRO NON/FICTION Mosc, 25—29.XI.2015 Das de literatura en espaol. XVII Feria Internacional del Libro non/ction : Mosc, 25—29.XI.2015. Mosc : Instituto Cervantes, 2015. — 95, [1] p. NIPO 503-15-006-9 ДНИ ЛИТЕРАТУРЫ НА ИСПАНСКОМ ЯЗЫКЕ 17 МЕЖДУНАРОДНАЯ ЯРМАРКА ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ NON/FICTION Москва, 25—29 ноября 2015 г. Дни литературы на испанском языке. 17 Международная ярмарка интеллектуальной литературы non/ction : Москва, 25—29...»

«ПРЕАМБУЛА Колледж основан в 1930 году. До 1991 года назывался «Ростовский автодорожный техникум». Приказом № 59-ор Государственного концерна «Росавтодор» от 06.08. 1991 года был переименован в «Ростовский автодорожный колледж». Приказом Федерального дорожного агентства от 07.12.2004г. № ОБ-130 переименован в «Федеральное государственное образовательное учреждение среднего профессионального образования «Ростовский-на-Дону автодорожный колледж». На основании приказа Федерального агентства по...»

«Vdecko vydavatelsk centrum «Sociosfra-CZ» Kama Institute of Humanitarian and Engineering Technologies Tashkent Automobile and Road Institute Tashkent Automobile and Road College SCIENCE, ENGINEERING AND TECHNOLOGY IN THE CONTEXT OF GLOBALIZATION: PARADIGMATIC CHARACTERISTICS AND PROBLEMS OF INTEGRATION Materials of the international scientific conference on October 28–29, 2015 Prague Science, engineering and technology in the context of globalization: paradigmatic characteristics and problems...»

«Приложение к приказу Министерства образования Республики Башкортостан от 17.03.2014 № 412 Состав Государственной экзаменационной комиссии Республики Башкортостан Председатель Государственной экзаменационной комиссии Республики Башкортостан: Гаязов министр образования Республики Башкортостан 1. Альфис Суфиянович Заместитель председателя Государственной экзаменационной комиссии Республики Башкортостан: Аристархов заместитель министра образования 2. Владимир Викторович Республики Башкортостан...»

«ГОРОДСКОЙ КОНКУРС НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ И ТВОРЧЕСКИХ РАБОТ «ШАГ В НАУКУ» Секция: Лингвистика. Тема: Американский образ жизни: фаст-фуд. (American way of life: fast food). Автор: Боярских Алиса Научный руководитель: Гущина Марина Сергеевна Место выполнения работы: МКОУ СОШ № Содержание Введение Главная часть 1. Фаст-фуд: вид еды или образ жизни? 1.1. Что такое фаст-фуд? 1.2. Как все начиналось. 1.3. Причины популярности. 1.4. Место фаст-фуда в жизни американского общества. 2. Фаст-фуд: «пища...»

«http://www.sandronic.ru/v-gostyah-u-gorga-beseda-s-interesnyim-chelovekom Беседа Александра (Сандро) Джорджадзе с Дмитрием Халезовым или «Разговор с экстремистом» Дорогие Друзья!!! Разве может не заинтересовать человек, считающий себя патрицием и любящий Турецкое Рондо Моцарта. Экстремистское мировоззрение и выбор в качестве любимой книги Библии. Воюет с американцами и пытается доказать, что если кто и является ядерными террористами, то только они сами. Ну, как тут не пригласить такого человека...»

«Po9cl/ I lА MИ HOБ PHAУ К И Ф FI ltrPAг | Ь HoЕг oс yд APс т BEHHoЕ Б ] QPlЕ г |.| oE oБ PA3oBAт Е л Ь HoE '.| PDк Д EHи E )/ BЬ lс ] lJEг o п PoФ Eс с и ol.tAл Ь Hoг ooБ PA3oBAHи '| к BoPoHEж с к и Й г ocy Д APс т BEHHЬ lЙ y Hи BEPс и т Eт D Б oPи с oг л Е Б с к и Й Ф и I I L| Aл ( Б Ф Ф г Б oy Bп o к BГ У ) yт BEP) к д Aю 3aв eд yю щ и йк aф eд poЙ Т eopи и и Meт oд И к lI iА aч aл ь Hoг o oб paз oв aн и Я ­ т/­/7­,7/,,., И 'И ' П я т и б paт oв a 22'10. 201 PAБ o Ч AЯ п Po г PAMMA y Ч Е Б...»

«AZRBAYCAN RESPUBLKASI MDNYYT V TURZM NAZRLY M.F.AXUNDOV ADINA AZRBAYCAN MLL KTABXANASI Milli Kitabxana – 85 YEN KTABLAR Annotasiyal biblioqrafik gstrici buraxl IV БАКЫ – 2009 AZRBAYCAN RESPUBLKASI MDNYYT V TURZM NAZRLY M.F.AXUNDOV ADINA AZRBAYCAN MLL KTABXANASI YEN KTABLAR 2008-c ilin drdnc rbnd M.F.Axundov adna Milli Kitabxanaya daxil olan yeni kitablarn annotasiyal biblioqrafik gstricisi Buraxl IV BAKI 2009 Trtibilr: L.Talbova S.abanova Ba redaktor: K.Tahirov Redaktor: T.Aamirova Yeni...»

«Подбор и адаптация персонала Книга№ Оглавление 1. Планирование процедуры поиска и отбора персонала. 2. Анализ и проектирование работы.. 3. Определение основных источников привлечения кандидатов.1 4. Выбор методик привлечения кандидатов.. 5. Технологии первичной диагностики и отбора кандидатов. 6. Техника собеседования при отборе и найме кандидатов.4 7. Дополнительные источники получения информации о кандидате.6 8. Технологии адаптации персонала.. 2 1.1. Планирование численности персонала...»

«STUDIA RUSYCYSTYCZNE Uniwersytetu Jana Kochanowskiego TOM 22 RUSSIAN STUDIES University of the Jan Kochanowski Vol. 22 Edited by Lidia Mazur-Mierzwa STUDIA rUSycySTyczne Uniwersytetu Jana Kochanowskiego TOM Pod redakcj Lidii Mazur-Mierzwy Wydawnictwo Uniwersytetu Jana Kochanowskiego Kielce 2014 Kolegium Redakcyjne prof. dr hab. Eleonora Lassan (Litwa) prof. dr hab. Aleksiej Gazkow (Rosja) prof. dr hab. Walentyna Gierasimczuk (Ukraina) prof. dr hab. Margarita Gawrilina (otwa) prof. UJK dr hab....»

«Результаты мониторинга образовательных достижений четвероклассников в конце учебного года (2013-2014 учебный год) Формы представления результатов мониторинга: 1. Профиль учащегося 1 «Результаты обследования учащегося 4-го класса в конце учебного года (2014 г.)».2. Профиль класса «Результаты обследования учащихся 4-го класса в конце учебного года (2014 г.)». 3. «Результаты оценки образовательных достижений учащихся 4 класса в конце учебного года (2014г.)». 4. Профиль учащегося 2 «Динамика...»

«Третьи просто мало кому известны, незачем их популяризировать лишний раз. Четвёртые не имеют отношения к нашей теме. Например, у Е. П. Блаватской есть и «арийская раса», и Атлантида, а у её последователей — даже и Шамбала, однако нет других компонентов расистского мифа. Поскольку расисты были плагиаторами, поскольку они обворовывали многих авторов, нет смысла искать, у кого совпадает хоть одно ключевое слово. Не будем рассматривать мифы классического национализма XIX века — автохтонистские или...»

«ПАКЕТ ТИПОВЫХ ДОКУМЕНТОВ ДЛЯ СТРУКТУРИРОВАНИЯ СДЕЛОК РАННЕЙ СТАДИИ Москва Расширение бизнес–ангельского движения служит необходимым условием здорового и стабильного развития венчурного рынка. Внушительные темпы роста российского рынка – он два года подряд практически удваивался – связаны, главным образом, с притоком больших частных денег. Но мы наблюдаем сильный стадийный дисбаланс: половина всех инвестиций идет в проекты поздних стадий, а на компании посевной стадии пока  направлен ...»

«CEDAW/C/TJK/4-5 United Nations Convention on the Elimination Distr.: General 9 November of All Forms of Discrimination against Women Original: Russian ADVANCE UNEDITED VERSION Committee on the Elimination of Discrimination against Women Consideration of reports submitted by States parties under article 18 of the Convention on the Elimination of All Forms of Discrimination against Women Tajikistan Combined fourth and fifth periodic report [4 August 2011] GE.1 CEDAW/C/TJK/4-5 Сводный четвёртый и...»

«СОДЕРЖАНИЕ ВОЕННЫЕ МУЗЕИ МИРА Музейный комплекс Ватерлоо (Публикация С.П. СИДОРОВА) 2-я стр. The “Waterloo” Museum Complex (Publication of S.P. SIDOROV) обл. ВОЕННАЯ СИМВОЛИКА 2-я стр. Раритетная коллекция фалеристики военных санаториев Кавказских Минеральных Вод Rarity collection of military resorts’ faleristics in the Caucasian Mineral Waters цв. вкл. ПОЛКОВОДЦЫ И ВОЕНАЧАЛЬНИКИ 4-я стр. «Мужественный до дерзости Багратион» “Bagration was courageous up to impudence” цв. вкл. ПРОТИВ ЛЖИ И...»

«За свободные и честные СМИ в Беларуси Отчет международной миссии в Беларусь 20-24 сентября 2009 года Организации-составители: ARTICLE 1 «Защитники гражданских прав» (Civil Rights Defenders) Датский союз журналистов (Danish Union of Journalists) «Индекс цензуры» (Index on Censorship) Международная/Европейская федерация журналистов (International/European Federation of Journalists) «Международная медиа-поддержка» (International Media Support) Международная ассоциация издателей (International...»

«Совет при Президенте Российской Федерации по науке и образованию Координационный совет по делам молодежи в научной и образовательной сферах Дайджест новостей сферы науки и образования ЯНВАРЬ 20 (по материалам сайта youngscience.ru) СОДЕРЖАНИЕ Новости... 2 Событие месяца: Открытие штаб-квартиры Русского географического общества в Москве.... Президент России: события, встречи, совещания с участием Главы государства. 4 Главные новости сферы науки, образования и технологий на сайте...»

«В-31 Рисунки В. Бескаравайного, Л. Милорадович, В. и Л. Петровых Оформление и вклейки Ю. Смольникова СЛЕДОПЫТ ЗЕЛЕНОГО МИРА Детство. До дыр зачитанные романы Майн Рида, Фенимора Купера, Луи Буссенара, Жюля Верна и уж, конечно, «Робинзон Крузо» Дефо. Как хотелось бы ему самому стать героем удивительных приключений, участни­ ком заманчивых путешествий! Но как еще до этого далеко! А пока мечты мальчишек находили свой выход. Прочитанное оборачивалось увлекатель­ ной игрой. Каждое воскресенье они...»

«Сергей Михайлович Голицын Сорок изыскателей Сергей Голицын СОРОК ИЗЫСКАТЕЛЕЙ Дорогие читатели! Перед вами – книга, написанная двадцать с лишним лет назад. Книга эта и веселая, и грустная, и поэтичная. А посвящена она юным изыскателям. Кто такие изыскатели? Это те мальчики и девочки, а также те взрослые, которые все время что-то придумывают, изобретают, ищут – на земле, под водой, в воздухе и даже в космосе. С тех пор как написана эта книга, многое изменилось. Сейчас юные туристы...»








 
2016 www.nauka.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Книги, издания, публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.